本篇文章引用自
前言：
根據世界衛生組織數據，全世界每年有超過 200 萬人死於身體脂肪過多的併發症。民國110年台灣的十大死因中便包含了慢性肝病及肝硬化。西方國家認為是脂肪肝變成脂肪性肝炎，再變成肝硬化後，才會發生肝癌。非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 與許多代謝症候群(MetS)有關，包括糖尿病、肥胖症和高血壓。
肝臟是身體負責排毒、代謝毒素的重要角色，其功能之一就是代謝脂肪。食物中的脂肪被消化為脂肪酸而進入肝臟代謝，成為膽固醇及三酸甘油脂後運出肝臟外。若這個過程出了問題，即會造成三酸甘油脂積在肝細胞內形成脂肪泡粒，於是乎脂肪肝就形成了。脂肪肝之所以會導致發炎，是因為脂肪細胞會累積毒素。
黑種草 (Nigella sativa, NS) 中的百里醌成分，基於其抗氧化特性，已被提議作為對抗多種代謝疾病的保護因子。 黑種草（毛茛科），俗稱黑籽或黑孜然，是一種在中亞和東南亞種植了數千年的草本植物。 從NS中提取的精油含有豐富的揮發性餾分，包括百里醌 (TQ) 和麝香醌 (THQ) 。 百里醌 (TQ) 是 NS 的主要藥理活性化合物，被認定為具有許多治療特性，包括抗炎、抗氧化和抗高血糖作用。 TQ 的保護作用與其清除活性氧 (ROS) 的能力有關，包括超氧化物和羥基自由基、阻斷脂質過氧化和提高抗氧化酶水平。
目的：
本研究的目的是證明具有高含量 TQ 的黑種草籽油對代謝狀況的影響，包括以脂肪為媒介的發炎脂肪素之釋放，如NOV(腎母細胞瘤過度表現)、粒線體生合成、LDL(低密度膽固醇)、Ox-HDL (氧化高密度膽固醇)和肝脂肪變性在肥胖老鼠模型中。
方法：
八周大的 C57BL/6雄性老鼠被餵食脂肪含量為 51% 的西方飲食，而對照組老鼠則被餵食常規飲食、高脂肪飲食(HFD)（高脂飼料來源：Harlan，Teklad Lab 動物飲食，印第安納波利斯，印第安納州）20 週。 將老鼠分為三個治療組，每組五隻動物，如下所示：
- 第 1 組：Lean
- 第 2 組：HFD
- 第 3 組：HFD 且最後 8 週治療，HFD 治療最後 8 週，黑種草籽冷榨油配方［含有從 TriNutra Israel 獲得的 3-3.1% 的百里醌 (TQ)］。
TQ油的配方如下：TQ含量 3.14%、傘花烴含量1.24%、香芹酚含量0.08%、游離脂肪酸(FFA)含量1.29%、油酸含量 21.53%、棕櫚酸含量11.31%、亞油酸含量57.44%、其他脂肪酸含量1.98% 和D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)含量0.8%。 將 TQ 油混合到 HFD 食品中，並使用混合器製成顆粒。
（註：TQ具有抗氧化及抗炎作用；傘花烴具有祛痰作用和抗炎作用；香芹酚具有拮抗微生物活性的作用，另外還有消炎、鎮痛及抗發炎的特性，常用於殺菌、消毒；FFA在代謝調節中發揮重要作用；油酸為常見的單不飽和脂肪酸，與降低低密度膽固醇(LDL)有關；棕櫚酸可以當作細胞用來產生能量的燃料，而棕櫚酸是細胞膜、肺分泌物和一些調節細胞活動的信號分子的關鍵成分；亞油酸即omega-6，具有降低血膽固醇及血脂、軟化血管、降低血壓、促進微循環的作用；TPGS是維生素E的合成水溶性版本。）
在實驗結束時，小鼠被安樂死，評估總體重、脂肪含量和肝纖維化。 所有動物實驗都遵循紐約醫學院實驗動物照護及使用委員會機構批准的協議，符合美國國家衛生院指南。
空腹血糖、葡萄糖耐受性試驗
在禁食 6 小時後從尾部血液測量空腹血糖和葡萄糖耐受性。 使用 CODA 尾套系統（Kent Scientific，CT，Torrington）通過尾套方法測量血壓。
耗氧量的測定
實驗組中的C57BL/6老鼠在耗氧室中適應 3 週的時間。 在這三週的適應期中，每週三次以兩小時為增量執行。 Oxylet 氣體分析儀和氣流裝置（Oxylet，Panlab-Bioseb，Vitrolles，法國）用於測定老鼠耗氧量（VO2） 每隻老鼠單獨放置在機器中，VO2、VCO2 和呼吸商 （RQ = VCO2/VO2）。 VO2 的數據表示為每公斤體重每分鐘消耗的氧氣 (ml/kg/min) 。
HO 活動的測量
通過 Abraham 等人的方法測定肝微粒體 HO活性，其中肝組織在pH 7.8磷酸鹽緩衝液（0.1 mM EDTA 和 1mM PMSF）中勻漿。 在 20 uM 血紅素、6-磷酸葡萄糖（G-6P）、葡萄糖-6-磷酸去氫酶（G6PDH）、NADPH 中，在 37°C 下測量 HO 活性 60 分鐘。 膽紅素是 HO 降解的產物，用氯仿提取後離心並放置在冰箱中過夜。 樣品解凍； 將樣品震盪 20 分鐘，然後用移液管移除含有氯仿的下層。 氯仿中的膽紅素濃度通過分光光度法（Perkin-Elmer（康涅狄格州諾沃克）雙紫外/可見光束分光光度計）使用λ460 至λ530 nm 波長處的吸光度差異以及 40 mM-1 和 cm-1 的吸收係數測定。
西方墨點法分析
對於蛋白質表現分析，肝組織在補充有蛋白酶和磷酸酶抑製劑（cOmpleteTM Mini 和 PhosSTOPTM，Roche Diagnostics，印第安納波利斯，印第安納州）的 RIPA 裂解緩衝液中裂解。冷凍老鼠脂肪組織在液態氮下研磨並懸浮在勻漿緩衝液（包含 mmol/L：10 磷酸鹽緩衝液、250 蔗糖、1.0 EDTA、0.1 PMSF 和 0.1%v/v 特吉糖醇，pH 7.5）。 以體外西方墨點法分析測量裂解沉澱的細胞、 HO-1、HO-2、OPA1、MFN1、MFN2 和 NOV 蛋白。 使用在 800 nm 和 700 nm 處吸收的二次紅外熒光染料偶聯抗體進行蛋白質檢測。 使用 Odyssey 紅外成像掃描儀 (Li-Cor Science Tec) 可觀察到墨點，並通過用 β-肌動蛋白標準化後進行的光密度分析進行量化，結果以AU為單位表示。
肝組織的組織病理學檢查
每個實驗組的肝臟樣本固定在 4% 多聚甲醛中脫水，包埋在石蠟中並切片（6 μm 厚）。 NAFLD 中常見的主要肝臟組織病理學特徵包括脂肪變性、炎症、肝細胞氣球樣變和纖維化，根據 NAFLD 組織學活動評分 (NASH) 系統進行評分，並如前所述進行脂滴分析 ：通過分析 96 孔板的單個孔的整個底部表面積，獲得脂滴大小和數量。每個實驗一式三份進行，並進行液滴分析。照片是實驗條件的代表性圖像。使用 ImagePro 分析儀（MediaCybernetics, Inc., Rockville, MD）測量細胞大小。脂滴大小的分類基於二維區域的大小，並如之前所述表示為像素。
細胞培養和脂肪細胞分化
3T3-L1 老鼠前脂肪細胞購自美國典型培養物保藏中心（美國馬里蘭州羅克維爾）。 解凍後，將 3T3-L1 細胞重懸於 DMEM 中，補充 10% 熱滅活胎牛血清（FBS，Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國）和 1% 抗生素/抗真菌溶液（Invitrogen）。 將培養基替換為脂肪形成培養基，並將細胞再培養 6 天。 分化的 3T3-L1 前脂肪細胞用 3% TQ (2, 4, 6 M) 處理 6 天。
油紅O染色
使用含 0.21% 油紅 O 的 100% 異丙醇（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）進行染色。 簡而言之，脂肪細胞在 10% 甲醛中固定，用油紅 O 染色 10 分鐘，用 60% 異丙醇（Sigma-Aldrich）沖洗，油紅 O 通過加入 100% 異丙醇 10 分鐘洗脫，光密度（OD ) 在 490 nm 處測量，讀數為 0.5 秒。
結果：
TQ對體重、血壓、空腹血糖和耗氧量的影響
我們檢查了 TQ 對餵食 HFD 20 週老鼠的影響（圖 一）。 與對照組相比，餵食HFD老鼠的血壓和空腹血糖水平升高（圖一A和B）。TQ降低了餵食HFD老鼠的血壓和空腹血糖水平。HFD老鼠的 VO2（耗氧量）消耗量減少。 相反地，TQ 使耗氧量顯著增加 (p<0.05)（圖 1C）。 如圖1D所示，與Lean相比，HFD 組的體重有所增加 (p<0.05)，但 HFD 和 TQ 組之間沒有差異。
圖一、TQ對血壓、血糖、耗氧量和體重的影響。 結果是平均數±標準誤，n=5，*p<0.05 vs Lean組，#p<0.05 vs HFD組 。
TQ對體外脂肪生成的影響
與分化的對照細胞相比，TQ降低了分化的脂肪細胞中的大脂滴含量 (p < 0.05)（圖二A和B）。 此外，TQ3 3% 減少了油類脂質積累，在分化細胞和6μM TQ 3% 處理的細胞之間明顯可見，這表明 TQ 減少了脂肪細胞終端分化，阻止了小的“健康”脂肪細胞向大脂肪細胞的轉化。 TQ以*劑量依賴性方式降低脂質含量（圖二B）［*劑量依賴性：是根據劑量調整（在一定範圍）提高療效]。 Sardana 和 Kappas 的報告指出，HO-1 mRNA和蛋白質的增加比肝臟HO活性的增加高幾個等級 ，因此我們測量了TQ處理對肝臟 HO 活性和膽紅素抗氧化劑產生的影響。由於HO-1將血紅素轉化為等摩爾量的 CO 和膽紅素，我們通過膽紅素的形成來測量HO活性。對照肝組織中的HO活性為0.81±0.16nmol膽紅素形成/mg蛋白質/小時，在高脂肪肝中降至0.49±0.12nmol膽紅素形成/mg蛋白質/小時(p<0.05)（圖三B-F）。3% TQ 對 HO-1蛋白的刺激作用與 HO活性有關（圖三G），使其增加至 0.78 ± 0.12 nmol 膽紅素/mg/小時（p<0.05）。
圖二、TQ對3T3脂肪細胞油滴形成的影響。我們測量了3%TQ給藥對脂肪生成的影響。每日補充TQ，共6天，對脂肪生成抑制有效。TQ處理顯示3T3脂肪細胞中脂滴形成顯著 (p<0.05) 減少。n=5，*p<0.05，與未分化對照組(Ctrl Und)相比，#p<0.05 與分化對照組(Ctrl Diff)對比。
圖三、TQ 給藥對 Lean、HFD和HFD+3%TQ 脂肪組織中pIR972、MFN2、NOV、Fis1和HO-1水平的影響。代表性的蛋白質墨點印跡(A)和(B)pIR972、(C)MFN2、(D)NOV、(E)Fis1、(F)HO-1的Lean、HFD 和 HFD+3%TQ的光密度分析。 結果是平均數±SE，n=5，*p<0.05，與Lean相比，#p<0.05，與HFD相比。
圖三G、對照組、HF 組和用 3%TQ處理的 HF組中老鼠的 HO 活性。確定了HO活性，結果為平均數±標準誤，n = 5，*p < 0.05，與對照組相比，#p < 0.05，與HF組相比。
TQ對脂肪組織蛋白表現的影響
脂肪組織的蛋白質墨點分析顯示，與對照組相比，肥胖老鼠的pIR972、MFN2、NOV、Fis1和HO-1蛋白表達水平存在顯著差異（圖三）。 與年齡匹配的瘦老鼠(Lean)相比，未經治療的肥胖動物表現出胰島素受體磷酸化水平和 HO-1 的顯著 (p<0.05) 降低（圖三F）。 TQ 增加了肥胖老鼠的 pIR972 線粒體融合蛋白和 HO-1 水平（圖三B和F）。 HFD導致MFN2減少(p<0.05)和 FIS-1分裂蛋白增加 (p<0.05)。 與HF老鼠（高油脂飲食）相比，TQ 治療逆轉了對線粒體蛋白的負面影響，如MFN2水平升高（p<0.05）和 FIS-1 降低（p<0.05）所示（圖三C和E）。 如圖 4D 所示，Lean組中脂肪組織衍生的 NOV（一種促炎蛋白）水平顯著 (p<0.05) 低於HFD 組。 如圖三D所示，與單獨餵食HFD的老鼠相比，TQ 治療降低了 NOV蛋白表達。
TQ的干預可降低血脂、脂肪變性和纖維化水平
瘦鼠的肝臟（Lean組）沒有表現出明顯的脂肪變性，沒有炎症，也沒有纖維化（圖四和五）。HFD老鼠的肝臟則有脂肪變性增加、中度小葉炎症位點、肝細胞氣球樣變（肝細胞膨脹）和纖維化。 與對照組相比，餵食HFD老鼠的脂質含量（圖 四E）顯著增加（p<0.05）。 與單獨服用HFD的老鼠相比，TQ治療降低了脂質含量。 肝臟脂滴的形態分析表明，與HFD組相比，TQ 降低了脂滴直徑 (p < 0.05)（圖四D）。 如圖五所示，HFD老鼠未處理比使用TQ處理的HFD老鼠表現出更多的纖維化。 TQ減少了HFD誘導的纖維化和膠原蛋白沉積 (p<0.05)。
圖四、(A)Lean瘦鼠、(B)HFD、(C)用 1% TQ 處理的HFD和(D)用 3% TQ 處理的HFD老鼠的肝臟之蘇木精-伊紅染色。 圖表總結了(D)肝臟脂滴直徑和(E)脂肪組織百分比的形態分析。 *p< 0.05，與Lean相比； #p< 0.05，與HFD相比。 圖A-C比例尺： 50 𝜇ｍ。 黃色箭頭表示炎症細胞，綠色箭頭表示脂肪組織，*則表示小葉中心靜脈。
圖五、肝臟的Masson三色染色和纖維化的存在，(A)Lean、(B)HFD飲食、(C)HFD飲食+3%TQ。 圖表總結了纖維化百分比 (D)的形態分析。 *p<0.05 ，與對照組Lean相比； #p<0.05，與HFD相比。 A-C比例尺為50 𝜇m。
TQ對MFN-1、MFN-2、OPA1、NOV、HO-1和HO-2蛋白表達的影響
HFD控制組表現出較低的 MFN-1、MFN-2、OPA1 和 HO-1 肝蛋白表現。 TQ使肝臟的MFN-1、MFN-2、OPA1 和 HO-1 的水平顯著增加 (p < 0.05)（圖六B、C、D、F）。TQ阻止了HFD引發的 NOV（促炎蛋白）表現增加（圖六E）。 HO-2在實驗中沒有觀察到顯著變化（圖六G）。
圖六、TQ施用增加線粒體功能、抗氧化劑 HO-1 並減少肥胖老鼠肝組織中的促炎因子NOV。 (A)代表性的西方墨點法印跡和Lean、HFD和HFD+3%TQ實驗中(B)MFN1、(C)MFN2、(D)OPA1、(E)NOV、(F)HO-1 和 (G)HO-2的光密度分析。結果是平均數±標準誤，n=5，*p<0.05 ，與Lean相比；#p<0.05，與HFD相比。
TQ對血清氧化LDL、OX-LDL和HDL水平的影響
來自肥胖老鼠的血漿顯示出LDL和OX-LDL（氧化高密度膽固醇）的增加以及HDL水平的降低（圖七）。 TQ 降低了LDL和OX-LDL的水平 (p<0.05)，HDL水平未受影響。
圖七、分別分析Lean、HFD和HFD+3%TQ 老鼠中(A) LDL、(B)OX-LDL和(C)HDL的血漿水平。 結果是平均數±標準誤，n=5，*p<0.05，與Lean相比，#p<0.05，與HFD相比。
結論：
在肥胖老鼠模型的代謝功能和脂肪肝，TQ的施用改善了脂肪肝的症狀：TQ治療肥胖老鼠通過降低脂肪細胞衍生的 NOV 水平和增加抗氧化基因HO-1的表達來改善脂肪和肝脂肪變性中的線粒體功能，從而增加線粒體生物發生、功能和融合潛能，從而導致改善在肥胖老鼠的氧化應激和炎症。